Im Zuge der Reformation wird 1539 der Berliner Franziskanerkonvent aufgelöst. Die Franziskaner erhalten jedoch lebenslanges Wohnrecht im Klostergebäude. 1571 stirbt der letzte Mönch, Bruder Peter, und Teile des ehemaligen Klostergebäudes werden Leonhard Thurneysser überlassen, einem medizinischen Gelehrten am Hofe des Brandenburger Kurfürsten Johann Georg. Dort richtet er seine Wohnung, eine Bibliothek, ein Labor sowie die erste Druckerei Berlins ein. 1574 wird die erste Landesschule in Brandenburg gegründet – das Gymnasium zum Grauen Kloster – und zieht in Teile des Klostergebäudes ein. Der Name geht auf das für die Berliner Franziskaner typische graue Gewand zurück. Das Gymnasium entwickelt sich zu einer der bedeutendsten Bildungseinrichtungen des Berliner Bürgertums. Zu den ehemaligen Schülern zählen u.a. der Architekt Karl Friedrich Schinkel, der Pädagoge und nationalistische Publizist Friedrich Ludwig Jahn sowie der erste Reichskanzler, Otto von Bismarck. In den Jahren 1842 bis 1845 werden nach Entwürfen der Architekten Christian Gottlieb Cantian und Karl Friedrich Schinkel umfangreiche Renovierungsarbeiten sowie historisierende Veränderungen durchgeführt.